[Detección rápida y sencilla de mutaciones puntuales CD17 en β-talasemia hereditaria] Talasemia hereditaria

Palabras clave: mutación puntual; polimerasa; talasemia hereditaria; detección de mutaciones genéticas

Número de clasificación de la biblioteca china: Q319.31 Código de identificación del documento: A Número de documento: 1007 -7847(2007)04 -0295-06.

La beta talasemia (β-talasemia) es una enfermedad genética autosómica recesiva causada por mutaciones o deleciones en el gen de la β-globina, que resulta en una reducción o incapacidad para sintetizar la cadena peptídica de la globina HbA (α2β2). lo que lleva a un desequilibrio en la síntesis de las cadenas peptídicas α y β. Si el feto recibe dos genes de β-talasemia de ambos padres al mismo tiempo, es homocigoto para la mutación y la mayor parte del feto mostrará β-talasemia grave. Actualmente no existe un tratamiento eficaz. Estos pacientes a menudo mueren jóvenes o se mantienen con transfusiones de sangre.

Las mutaciones puntuales son las mutaciones más comunes en el gen de la beta-talasemia. La mutación puntual CD17(A→T) en el gen de la β-globina es una de las primeras mutaciones puntuales reportadas asociadas con la β-talasemia. El método tradicional de detección de mutaciones del gen de la β-talasemia se basa en la electroforesis en gel. La cirugía es compleja y requiere mucho tiempo. El método de diagnóstico más utilizado actualmente es la reacción en cadena de la polimerasa combinada con hibridación por transferencia puntual, que es muy precisa, pero requiere etiquetado con isótopos radiactivos y una tecnología de hibridación molecular engorrosa. Pun et al. informaron sobre una nueva tecnología desnaturalizante de genotipado por cromatografía líquida de alto rendimiento que no requiere etiquetado con isótopos radiactivos. Sin embargo, el método es complejo de operar, el equipo es costoso y el ciclo experimental es largo. La tecnología de PCR de fluorescencia en tiempo real recientemente desarrollada se ha utilizado para detectar mutaciones puntuales del gen HFE en la hemocromatosis hereditaria. Es simple de operar, pero la dificultad del diseño de la sonda y el alto costo de los instrumentos de detección limitan su amplia aplicación.

Basándonos en el principio de que los colorantes de unión de doble cadena están incrustados en el ADN de doble cadena y emiten fluorescencia, establecimos un método simple para la detección en tiempo real de la actividad de la polimerasa a temperatura ambiente. Sobre esta base, basándose en la tecnología de extensión de polimerasa y las características de los tintes de inclusión específicos de doble cadena, se desarrolló un método de detección en tiempo real rápido y sencillo de mutaciones puntuales. La detección de mutaciones puntuales se logra mediante la inclusión de tintes y el cambio de señales de fluorescencia sin instrumentos costosos. . La operación es conveniente y simple, y no hay necesidad de operaciones complicadas de electroforesis en gel ni etiquetado. Este método se utilizó para detectar la mutación del gen CD17 relacionado con la β-talasemia, que proporciona un método rápido, sencillo y eficaz para la detección de mutaciones puntuales genéticas y polimorfismos de un solo nucleótido, y es útil para la detección de fármacos, la prevención de enfermedades y las pruebas de monómeros. La planificación tipográfica proporciona nuevos medios e ideas.

1 Experimento

1.1 Reactivos e instrumentos

Reactivos: Los cebadores y oligonucleótidos fueron sintetizados por Dalian Takara Biotechnology Company (Takara). Las secuencias se muestran en la Tabla 1. . Fragmento de Klenow (exo-) polimerasa (enzima KF, Fermentas), SYBR Green I (Shanghai Science and Technology Development Co., Ltd.), enzima Takara Ex taq (TakaRa), mezcla DNTP (TakaRa), Tris (Sigma), El alcohol ditiotreosa DTT (Bebco) y otros reactivos son de calidad analítica doméstica y el agua experimental se ha filtrado y esterilizado a altas temperaturas. El instrumento fue un espectrofotómetro de fluorescencia American Perkin Elmer LS-55, un baño de agua a temperatura constante American Amersham y un ABI Ce-neAmPTM PCR System 2700.

1.2 Métodos experimentales

1.2 1 Medición de fluorescencia

En este estudio, se utilizó el colorante de unión específica bicatenario SYBRGreen I para medir la intensidad de fluorescencia con 497 nm luz.

La rendija incidente y la rendija de emisión del instrumento se ajustan a 2,5 nm. Una vez estable el valor de fluorescencia, la muestra se mide a una temperatura constante de 37 °C durante 65438 ± 00 min. El volumen final de la solución de muestra es de 200 μl. ..

1.2. Detección de mutación de 2 puntos

Prepare la solución básica de 1 (cebador N3 100 nmol/L, 50 mmol/L LTRIS-HCl (pH 8,0), 5 mmol/ L MgCl2, 1 mmol/L ldtr. 50 μmol/L de mezcla de DNTP, 1×SYBR GreenI), agregar n1 y N2 con una concentración final de 100 nmol/L, agregar 1 mmo|/L de DTF, 50 μmol/L de mezcla de dNTP. (misma proporción), 1 x SYBR GreenI) y una concentración final de 100 nmol/l de N2 y N2 se añadieron al líquido del fondo 2 respectivamente. Después de que la intensidad de la fluorescencia sea estable, agregue 2,5 U de enzima KF y controle continuamente los cambios en la intensidad de la fluorescencia.

1.2.3 Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante

Utilice métodos de electroforesis tradicionales para verificar los resultados de detección de mutaciones puntuales. Las soluciones de muestra A, B y C se desnaturalizaron a 95 °C durante 5 minutos, luego se enfriaron a 0 °C durante 5 segundos y se analizaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 20 % que contenía urea al 7 % y se tiñeron con plata.

1.2.4 Efecto de la temperatura en la detección

Agregue 2,5% a la solución de muestra A a 25 ℃, 30 ℃, 34 ℃, 37 ℃, 42 ℃ y 47 ℃ U respectivamente. Enzima KF, monitorea los cambios en la intensidad de la fluorescencia. Utilizando la relación del valor de la señal de fluorescencia de la reacción de polimerización de 1000 (S/B) como estándar de detección, se investigó el efecto de la temperatura en el sistema de detección.

1.2.5 Influencia de los iones metálicos en la detección

Se estudió la influencia de cuatro iones metálicos (M2+, Ca2+, K+ y Na+) en la polimerización de la polimerasa, y ajustando la muestra. solución La concentración de cloruro de magnesio en A se utilizó para estudiar el efecto del Mg2+. Agregue soluciones de CaCl2_2, KCI y NaCl a la muestra A para ajustarla a diferentes concentraciones, calcule la velocidad de reacción inicial en la referencia [11] y examine el impacto de los iones en la reacción de polimerización.

1.2.6 Preparación y detección de muestras de mutación puntual para la enfermedad genética talasémica

Detectamos una mutación puntual CDl7(A→T) en la enfermedad genética talasémica. 10 muestras (3 homocigotos, 3 heterocigotos del Laboratorio de Genética Médica de Southern Medical University y 4 muestras normales de nuestro laboratorio). Extraiga el ADN genómico total de la muestra de los leucocitos de pacientes y personas normales según técnicas estándar de extracción de ADN, y el cebador (Tabla 65, 438+0) sigue al cebador 5. El sistema de PCR (50 μl) contiene: 0,5 U de enzima TakaRa Extaq, 0,2 mmol/l de mezcla de dNTP, 1 x tampón de PCR, 800 nmol/l de N6, 10 nmol/l de N7 y 50 ng de ADN total. El procedimiento de reacción de PCR es el siguiente: desnaturalización a 94°C durante 5 min, luego desnaturalización a 94°C. Recocido a 57 ℃ durante 35 s, extensión a 72 ℃ durante 30 s, ciclo 40 veces. El producto de la PCR se purificó mediante electroforesis en gel estándar y se detectó el valor de DO. En la solución del fondo 3 (cebador N5 de 100 mmol/l, Tris-HCl de 50 mmol/l (pH 8,0), MgCl2 de 5 mmol/l, LDTT de 1 mmol, 50.

2 Resultados y discusión

2.1 Principio experimental

El principio experimental se muestra en la Figura 1. Diseñe cebadores específicos de alelo cuyo extremo 3' termina en el sitio base mutado (polimórfico) de la plantilla cuando los cebadores coinciden perfectamente. , los cebadores se extienden para formar hebras dobles bajo la acción de la polimerasa, y el tinte específico de doble hebra se inserta en la región bicatenaria naciente y, sin embargo, la intensidad de la fluorescencia aumenta cuando la plantilla y el cebador no lo hacen. coinciden en sus extremos 3', los cebadores no pueden extenderse de manera efectiva y no hay cambios en la señal de fluorescencia.

2.2 Método de detección de mutación puntual

Según la literatura [13~]. 15], logramos la detección de mutaciones puntuales. Se utilizaron oligonucleótidos sintéticos para simular la secuencia objetivo de mutación puntual de CD17, una enfermedad genética de la talasemia (Tabla 1), en la que N1 y N2 representan respectivamente dos genotipos homocigotos de mutaciones puntuales, y el 50%. de las muestras mixtas N1/N2 simulan heterocigotos. La Figura 2 muestra los resultados de la detección de mutaciones puntuales utilizando cebadores específicos de alelo.

El extremo 3' del cebador N3 termina en el sitio de la base mutada y coincide perfectamente con el homocigoto de N1. Bajo la acción de la polimerasa, se añaden dNTP complementarios al extremo 3'-OH del cebador uno por uno para formar una estructura bicatenaria, y el tinte SYBR Green I se incrusta en la estructura bicatenaria para generar fluorescencia. Cuando la plantilla es homocigota para N2, el extremo 3' del cebador N3 no coincide con él, por lo que la reacción de extensión de polimerización no puede ocurrir de manera efectiva y la señal de fluorescencia no aumenta significativamente (curva 3). Cuando la plantilla es híbrida, la señal de fluorescencia también aumenta significativamente (curva 2), pero su tasa de crecimiento de fluorescencia es significativamente menor que la curva 1. Mediante cambios en la fluorescencia, se pueden distinguir eficazmente los tres genotipos. Para detectar mejor las mutaciones puntuales, también utilizamos para la detección el cebador N4, que coincidía completamente con el homocigoto N2. Cuando la plantilla sea N1, agregue polimerasa. Debido al 3 del cebador N4, cuando el molde es N2, la señal de fluorescencia aumenta rápidamente con la adición de ADN polimerasa. Cuando el molde es híbrido, la fluorescencia también aumenta, pero el grado de aumento es menor que el del cebador perfectamente emparejado. plantilla N2. Los resultados de la detección fueron los mismos que cuando se usó el cebador N3 (no se muestra en la figura).

2.3 Electroforesis en gel de poliacrilamida

Utilizamos electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante tradicional para verificar los resultados de la detección de mutaciones puntuales. En la Figura 3, los carriles 1 a 3 son las bandas N1, N2 y N3 respectivamente. Los carriles 4 ~ 6 son las soluciones de muestra de reacción de las soluciones de muestra A ~ C respectivamente. Descubrimos que en el carril 4 (solución de muestra A), la banda del cebador N1 desapareció porque el cebador N1 se usó como plantilla para la polimerización, pero apareció una banda de producto de polimerización encima de la banda del molde N1 (el cebador 5 fue diseñado para distinguir la polimerización. El producto resultante y el molde original, el carril 5 (solución de muestra B) no puede producir una reacción de polimerización eficaz, y las bandas del molde N2 y del cebador N3 continúan existiendo: el carril 6 es la solución de reacción de la solución de muestra C, y la banda del cebador, el molde y el producto de polimerización. Las bandas son visibles, sin embargo, el brillo de la banda del producto de polimerización es más débil que el del carril 4, lo que indica que el producto de polimerización es menor que el del carril 4. Los resultados de la electroforesis anteriores son consistentes con los resultados del experimento de fluorescencia, lo que indica que esta fluorescencia. El método de análisis es un método de genotipado confiable y preciso.

2.4 Efecto de la temperatura en la detección

Ajuste el baño de agua a temperatura constante para controlar las temperaturas a 25 °C, 30 °C, 34. °C, 37°C, 42°C y 47°C respectivamente. Agregue polimerasa a la solución de muestra A. Monitoree los cambios en la intensidad de la fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 4. A medida que aumenta la temperatura, la relación entre la señal de fluorescencia y la fluorescencia. fondo (S/B) aumenta cuando la temperatura aumenta Cuando supera los 37°C, S/B aumenta

2.5 Impacto de los iones metálicos en la detección

Se basa la detección de mutaciones puntuales. sobre la reacción de extensión de la polimerasa tiene una influencia importante en la generación de señal y la sensibilidad. Estudiamos la influencia de varios iones metálicos importantes (Mg2+, Ca2+, K+, Na+) en la reacción de polimerización (Figura 5). Imagine que cuando M no está presente, la reacción de polimerización no puede ocurrir a medida que aumenta la concentración de Mg2+, la velocidad de reacción inicial se acelera cuando la concentración de Mg2+ alcanza 10 ~ 15 mmol/L, la velocidad de reacción inicial es la más rápida. Al aumentar, la actividad de la polimerasa se inhibe hasta cierto punto, lo que indica que el Mg2+ es esencial como activador de la polimerasa en la reacción. Sin embargo, cuando la concentración de Ca2+ es superior a 30 mmol/L, se producen concentraciones bajas de Ca2+ (menos de 20). mmol/L) tienen poco efecto sobre la actividad de la polimerasa. La velocidad de reacción tiene un efecto inhibidor significativo; la presencia de K+ y Na+ inhibe la actividad de la polimerasa y, a medida que aumenta la concentración, la actividad de la polimerasa se inhibe. La concentración de K+ y Na+ es superior a 100 mmol/L, la reacción de polimerización se inhibe básicamente.

2.6 Genotipado de mutaciones puntuales en la talasemia

La talasemia es una enfermedad sanguínea hereditaria. detectó un tipo de mutación puntual CDl7. Los resultados se muestran en la Figura 6. Como se muestra en la figura, cuando no se agrega polimerasa, las señales de fluorescencia de los tres genotipos son similares, pero después de agregar la polimerasa, existen diferencias obvias entre los tres. genotipos Después de agregar la polimerasa, los homocigotos mutantes coinciden completamente. La señal de fluorescencia del cebador (N5) aumenta drásticamente (curva 1). Cuando se agrega el homocigoto de tipo salvaje a la polimerasa, la señal de fluorescencia no cambia significativamente (curva 3). Sin embargo, después de agregar el heterocigoto a la polimerasa, la señal de fluorescencia también aumenta considerablemente. Sin embargo, la fluorescencia es significativamente menor que la de los homocigotos mutantes (curva 2). La mutación de CDl7(A→T) se puede identificar de forma fácil, rápida y precisa.

3Conclusión

Basado en la tecnología de extensión de la polimerasa, mediante la encapsulación de tintes fluorescentes específicos de doble cadena, los resultados del genotipado de mutaciones puntuales pueden estar dados directamente por cambios en las señales de fluorescencia. Este método no requiere marcaje con radioisótopos ni marcaje fluorescente de cebadores y oligonucleótidos. Bajo costo; operación experimental simple, sin necesidad de detección por electroforesis en gel ni instrumentos complejos y costosos, proporcionando un método simple y rápido para la prevención y detección de enfermedades genéticas causadas por mutaciones puntuales, y también para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido. proporciona una nueva forma de pensar.

Acerca de los autores: Meng Xiangxian (1972 -), mujer, nacida en Huarong, Hunan, profesora asociada de la Universidad de Hunan, PhD, dedicada a la investigación de química bioanalítica a nivel molecular Wang Kemin (1957-) , hombre, nacido en Yuanjiang, Hunan, profesor, Ph.D., corresponsal, dedicado a la investigación en química bioanalítica y nanobiotecnología a niveles nano y molecular.