Descripción general de los métodos de detección de MSI

Por lo general, hay de 1 a 6 secuencias repetidas (como secuencias repetidas de un solo nucleótido, de dinucleótidos, etc.) dispuestas en series de 10 a 50 veces.

La inestabilidad de los microsatélites (MSI/MSI-H), debido al defecto funcional del gen de reparación de errores de coincidencia (MMR) durante la replicación del ADN, conduce a mutaciones de inserción y deleción en la secuencia en tándem, lo que resulta en cambios en la longitud de la secuencia MS Variedad.

Este tipo de mutación somática puede provocar la inactivación de genes supresores de tumores o la destrucción de otras secuencias reguladoras no codificantes, desempeñando así un papel cancerígeno.

Como fenotipo molecular único, MSI está presente en muchos cánceres, incluidos el colorrectal, endometrial, gástrico, de próstata, de ovario y glioblastoma.

MSI puede predecir la eficacia de la terapia de bloqueo de puntos de control inmunológico en tumores sólidos. Por tanto, la detección del estado de MSI es de gran importancia para el diagnóstico clínico y el pronóstico de los tumores.

Actualmente, existen tres métodos principales de detección de MSI:

El método IHC utiliza la expresión correspondiente de cuatro proteínas reparadoras de errores de coincidencia del ADN (MLH1, PMS2, MSH2, MSH6) en el núcleo. se utilizan para determinar si hay un defecto de reparación de desajuste en la celda.

Si falta alguna de las proteínas, se considerará como deficiencia de reparación de errores de coincidencia (dMMR), que es equivalente a MSI-H, si se expresan las cuatro proteínas, se considerará que el error de coincidencia; La función de reparación es normal (pMMR). Es decir, MSI-L o MSS.

Su ventaja es que se utiliza ampliamente y puede determinar qué proteínas MMR faltan en las células tumorales.

Sin embargo, la IHC en sí es subjetiva y se ve afectada por la calidad de los anticuerpos y factores experimentales. A veces no se pueden detectar algunos cambios cualitativos en las proteínas, lo que conduce a falsos positivos ocasionales en los resultados de MMR.

La PCR de fluorescencia múltiple combinada con electroforesis capilar amplifica principalmente una secuencia de microsatélites específica a través de PCR y luego utiliza electroforesis capilar para comparar la diferencia en la longitud de la secuencia de microsatélites entre el tejido tumoral y el tejido normal para determinar si el sitio existe el fenómeno MSI.

Este método de detección está reconocido como el estándar de oro para la detección de MSI y también es el método más utilizado.

Primero, se utilizaron los cinco loci recomendados por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI):

El estado de MSI del cáncer colorrectal se determinó mediante el siguiente método:

Las investigaciones muestran que no existe una diferencia significativa en las características biológicas del tumor entre MSS y MSI-L, por lo que MSI-L también se clasifica clínicamente como MSS.

Más tarde se señaló que la sensibilidad del sitio de las repeticiones de dinucleótidos es menor que la de las repeticiones de mononucleótidos, y existe un alto grado de polimorfismo individual, que debe compararse con muestras normales y tumorales compatibles. A conclusión. Por tanto, la sensibilidad de detección se reduce.

Por lo tanto, se propone un conjunto de pentadas, que contiene cinco sitios de repetición de un solo nucleótido:

No requiere muestras normales pareadas y tiene mayor rendimiento, pero sí en tipo deficiente en MSH6. Rendimiento en tumores es bajo.

El sistema Promega se usa actualmente más, incluyendo:

El método de detección por PCR no solo compensa las deficiencias de la IHC que no puede detectar MSI debido a mutaciones sin sentido que no se truncan, sino que también tiene buena repetibilidad.

Sin embargo, la cantidad de genes detectados (panel) es pequeña, el rendimiento es bajo, no puede proporcionar información de mutación genética específica y el ciclo experimental es largo.

Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, cada vez es más común utilizar la secuenciación del genoma completo (WGS), la secuenciación del exoma completo (WES) o la secuenciación genética dirigida (TGS) para detectar MSI. .

En comparación con la PCR, los métodos NGS tienen un mayor rendimiento, una gama genética más amplia, una mayor sensibilidad y especificidad, y pueden utilizar datos de secuenciación con detección de mutación objetivo y carga de mutación tumoral (TMB) utilizados juntos.

Entre los métodos NGS publicados, los resultados de la detección por PCR se utilizan generalmente como estándar de oro y la consistencia de los resultados se utiliza como estándar de comparación para evaluar el rendimiento de la detección NGS.

Existen muchos métodos de detección de NGS, la mayoría de los cuales requieren muestras normales pareadas. Podemos dividir estos métodos en dos categorías.

Aquí quizás tengas que explicar qué es el conteo repetido.

En la figura anterior, asumimos que el sitio del microsatélite tiene 10 A consecutivas. Hay 10 alineaciones de lectura en este sitio y la longitud de cada alineación de lectura es diferente. A partir de esto, podemos calcular el recuento de repeticiones.

La repetición es la duración de todas las lecturas y el recuento es el número de lecturas admitidas por cada longitud.

El proceso y el principio del análisis se pueden describir aproximadamente en el siguiente diagrama de flujo.

Incluyendo MSIsensor, mSINGs, MANTIS, Cortes-Ciriano, MSI-ColonCore, etc.

El proceso de análisis es similar al anterior.

Incluyendo índice MSIseq, clasificador MSIseq/NGS, Nowak, etc.

El sensor MSI se posiciona mediante las secuencias flanqueantes de 5 pb en ambos extremos del locus MS. El principio del algoritmo es el siguiente.

El método MSING también calcula la inestabilidad de cada sitio, utilizando el. Proporción de sitios inestables como muestra de puntos. Si es mayor que el umbral, se considera inestable.

MANTIS también calcula el estado inestable de la muestra basándose en la distribución del recuento repetido del tumor y sus muestras normales pareadas.

Toma la distribución del recuento repetido de cada sitio en la muestra como un vector, calcula la distancia euclidiana, la similitud del coseno y otras puntuaciones métricas para los dos vectores, y toma el promedio de todos los sitios como muestra Puntuación inestable .

El método de cálculo específico es el siguiente:

Como puede ver, este método está estrictamente controlado.

Este método se basa en datos de RNA-seq. Al calcular la relación PI/PD de los dos indicadores, si la relación es inferior a 0,9, la muestra se considera MSI.

Donde PI representa la proporción de mutaciones de inserción en sitios de microsatélites y PD representa la proporción de mutaciones de deleción en sitios de microsatélites.

Este método construye características calculando información de mutación, como la tasa de sustitución de un solo nucleótido, la tasa de inserción y eliminación de bases de fragmentos pequeños en la muestra, y luego aplica algoritmos de aprendizaje automático para construir un clasificador.

Las funciones específicas incluyen:

Este método utiliza datos WES y selecciona cuatro algoritmos: regresión lineal, árbol de decisión, bosque aleatorio y Bayes ingenuo. El algoritmo óptimo es un árbol de decisión, que no requiere pares de muestras normales.

De: Manual de aprendizaje del alfabeto.