Principios y pasos del experimento wb
Se une específicamente al primer anticuerpo correspondiente, luego se une a la enzima o al segundo anticuerpo marcado con isótopos y, finalmente, detecta los componentes proteicos expresados por el gen diana específico mediante el desarrollo del color del sustrato o la autorradiografía.
Preparación de muestras de proteínas
La muestra original pueden ser células, tejidos, sobrenadantes de cultivos, proteínas inmunoprecipitadas o purificadas por afinidad. Los siguientes son métodos de procesamiento de muestras de células para la detección cualitativa de proteínas objetivo. Consulte la literatura relevante para conocer otros métodos de preparación de muestras.
1.Cultivo de células o tratamiento farmacológico.
2. Deseche el medio de cultivo y lave las células dos veces con 1X PBS para eliminar el medio de cultivo residual.
3. Agregue tampón de muestra 1X SDS, raspe las células y transfiéralas al tubo Ep. NOTA: Opere sobre hielo.
4. Corte el ADN por ultrasonidos durante 10 ~ 15 segundos para reducir la viscosidad de la muestra.
5. Hervir la muestra durante 5 minutos.
6. Centrifugar a 12000g durante 5 minutos y recoger el sobrenadante.
Electroforesis SDS-PAGE
Primero, limpie la placa de vidrio
Segundo, pegue y muestree
1. alineado, colóquelo en la abrazadera y sujételo. Luego, fíjelo verticalmente al estante y prepárese para verter el pegamento.
2. Mezclar con gel separador al 10%, añadir TEMED y agitar inmediatamente antes de verter el gel. Al verter pegamento, use una pistola de 10 ml para aspirar 5 ml de pegamento y suéltelo a lo largo del vidrio hasta que la superficie del pegamento se eleve a la altura de la línea central del cinturón verde. Luego agregue una capa de agua al pegamento y el gel se gelificará más rápido después del sellado líquido.
3. Cuando hay una línea de refracción entre el agua y el pegamento, significa que el pegamento se ha solidificado. Después de que el pegamento se haya solidificado por completo durante 3 minutos, puedes verter el agua sobre el pegamento y secarlo con papel absorbente.
4. Mezclar gel concentrado al 4%, añadir TEMED, agitar inmediatamente y verter el gel. Llene el espacio restante con gel apilable e inserte el peine en el gel apilable. Cuando el gel concentrado se haya solidificado, sostenga ambos lados del peine con ambas manos y tire suavemente hacia afuera verticalmente.
5. Enjuague el gel concentrado con agua y póngalo en el tanque de electroforesis.
6. Agregue 1 × tampón de electroforesis de Tris-glicina o SDS a los tanques superior e inferior del tanque de electroforesis y cargue la muestra.
7. Conecte el tanque de electroforesis al instrumento de electroforesis. La ranura superior está conectada al electrodo negativo y la ranura inferior está conectada al electrodo positivo. El voltaje de carga es de 70 ~ 80 V, 100 V después de 10 minutos. Detenga la electroforesis después de 2 horas de electroforesis o cuando el azul de bromofenol migre a 1 cm del fondo.
Gira la película
1. Remoja el pegamento en el tampón de transferencia y equilibra durante 10 minutos. Nota: Si está detectando proteínas de moléculas pequeñas, este paso se puede omitir porque las proteínas de moléculas pequeñas se difunden fácilmente fuera del gel.
2. Recortar 6 trozos de membrana y papel de filtro según el tamaño del pegamento, colocarlos en el tampón de transferencia y equilibrarlos durante 10 minutos. Si se utiliza una membrana de PVDF, es necesario saturarla con metanol puro durante 3 a 5 segundos.
3. Armar la capa intermedia de transferencia: esponja con 3 capas de membrana de papel de filtro y 3 capas de esponja de papel de filtro. Después de colocar cada capa, use un tubo de ensayo para desalojar las burbujas de aire. Recuerde: el pegamento está en el lado equivocado (lado negro).
4. Coloque el tanque de transferencia en un baño de hielo, colóquelo en el sándwich (negro frente a negro), agregue el tampón de transferencia, conecte el electrodo, 100 V, 1 h (la corriente es de aproximadamente 0,3 A).
5. Una vez completada la transferencia de la película, corte la alimentación y retire la película mezclada.
Bloqueo e hibridación
1. Enjuagar la membrana con 25 ml de TBS durante 5 minutos a temperatura ambiente y agitar.
2. Colocar la membrana en 25ml de tampón de bloqueo durante 65438±0h a temperatura ambiente y agitar.
3,15mlTBS/T/t para un total de 3 veces (5min/T).
4. Agregue el anticuerpo primario diluido adecuadamente, incube a temperatura ambiente durante 1-2 h o 4 °C durante la noche y agite lentamente.
5,1,5 ml TBS/t, un total de 3 veces (5min/T).
6. Agregue el anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa de rábano picante (HRP) adecuadamente diluido, incube a temperatura ambiente durante 65,438 ± 0 horas y agite lentamente.
7,1,5 ml TBS/t, un total de 3 veces (5min/T).
Lavar una vez con 8,15 ml de TBS. 5
Colorante
Diluir y mezclar en proporción el líquido luminiscente A y el líquido luminiscente B. Enjuague ligeramente la membrana con agua desionizada, seque el papel de filtro en las esquinas, cubra las gotas mezcladas de A y B con el método de pegado inverso, apague la luz hasta que la banda fluorescente verde claro sea visible (aproximadamente 5 minutos) y luego coloque Seque las esquinas con papel de filtro, póngalas en una envoltura de plástico y fíjelas en una caja de película. Cubra rápidamente la película, cierre la caja de plástico y exponga según la intensidad de fluorescencia que vea.
Saca la película y sumérgela inmediatamente en el revelador durante 1 ~ 2 minutos. Enjuágalo con agua limpia y colócalo en el fijador hasta que la película esté completamente fijada. Enjuague con agua limpia y deje secar. Márcalo, analízalo y escanéalo.
Problemas comunes y soluciones en WB.
En primer lugar, baja intensidad de señal
Baja intensidad de señal significa que la banda objetivo obtenida en condiciones de exposición normales es muy pequeña o no tiene banda objetivo. Aumentar el tiempo de exposición dará lugar a. Alto fondo y ruido que trae demasiado y otros problemas. Eliminando la influencia de la calidad del reactivo y los errores operativos, las principales razones de estos problemas son las siguientes:
①Falta de expresión de proteínas en la muestra. Se recomienda agregar una línea celular con alta expresión de proteínas como control positivo, o aumentar adecuadamente el volumen de la muestra para obtener un mayor grado de señal;
②Degradación de proteínas. Preste atención al uso del inhibidor de proteasa PMSF durante la preparación de muestras de proteínas y detecte las muestras preparadas lo antes posible o guárdelas adecuadamente;
③Transferencia de proteínas. Para proteínas de alto peso molecular, es posible que se requieran tiempos de transferencia de membrana más prolongados utilizando membranas con tamaños de poro adecuados y optimizando los tiempos de transferencia de membrana.
④ Aplicación de anticuerpos. El tipo de reacción de anticuerpos y el tipo de experimento pueden satisfacer las necesidades del experimento. Además, la proporción de dilución y el tiempo de incubación del anticuerpo también deben optimizarse de vez en cuando durante el experimento.
⑤La tasa de separación de proteínas y anticuerpos es baja. Reduzca el número de lavados de membrana o acorte el tiempo de lavado de membrana, reduzca la concentración de NaCl en la solución de lavado de membrana, etc.
⑥El antígeno se cubre con una solución bloqueadora. Utilice una solución de bloqueo diferente para optimizar la concentración de proteína en la solución de bloqueo y acortar el tiempo de bloqueo;
⑦La concentración de metanol es demasiado alta. Las proteínas se separarán del SDS y precipitarán en el gel, lo que hará que el gel se encoja o se endurezca, inhibiendo así la transferencia de proteínas de alto peso molecular. En el experimento, la concentración de metanol se puede reducir o reemplazar adecuadamente con etanol y alcohol isopropílico.
En segundo lugar, bandas no específicas o posiciones de banda incorrectas.
Las bandas distintas de la banda objetivo en los resultados del WB se denominan bandas no específicas. A veces las bandas no específicas son obvias, pero no hay una banda objetivo, lo que causará una gran interferencia en el análisis. los resultados. En términos generales, los principales factores que provocan estos problemas son:
① Separación inespecífica de anticuerpos. En general, se cree que los anticuerpos policlonales son menos específicos que los anticuerpos monoclonales y es más probable que produzcan bandas no específicas. Reducir adecuadamente la concentración de anticuerpos puede ayudar a reducir las bandas híbridas. Al mismo tiempo, para excluir la posibilidad de una separación no específica por parte del anticuerpo secundario, se recomienda configurar un control negativo del anticuerpo secundario;
②El contenido de proteína de la muestra es demasiado alto. Reducir adecuadamente la cantidad de muestra cargada y extender el tiempo de lavado y bloqueo puede prevenir los efectos adversos del alto contenido de proteínas en los resultados experimentales;
③Degradación de proteínas. Hará que la posición de la banda cambie y produzca más bandas híbridas. Se recomienda utilizar muestras recién preparadas o muestras con menos ciclos de congelación y descongelación.
④ Demasiados pases celulares. Conducirá a la diferenciación de las formas de expresión de proteínas, por lo que se recomienda utilizar líneas celulares originales o con menos pases;
⑤Las proteínas tienen complejos. Algunas proteínas diana se disociarán y formarán complejos con otras proteínas, lo que provocará cambios en la posición de la banda. Es necesario revisar la literatura relevante para confirmar si la proteína puede formar complejos estables.
⑥En las proteínas existen empalmes o modificaciones diversas. Hay sitios de escisión en las proteínas locales y algunos cuerpos de escisión son inmunorreactivos y también pueden detectarse en WB. Además, algunas proteínas diana tendrán sitios de glicosilación u otros sitios de modificación, y el tamaño de la banda puede exceder con creces el peso molecular teórico. Por lo tanto, es necesario consultar la literatura o uniprot para comprender el tamaño de los sitios de modificación y escisión de proteínas.
En tercer lugar, el fondo es demasiado alto
En los resultados del WB local, el fondo que debería estar en blanco fuera de la franja también aparecerá más oscuro, interfiriendo con los resultados del análisis y el resultado. La imagen no será clara y será difícil de usar para la publicación de artículos. Las posibles razones de este problema son las siguientes:
①Bloqueo insuficiente. Una de las principales razones del alto nivel de antecedentes son los confinamientos problemáticos. Se recomienda utilizar agentes bloqueantes adecuados (leche desnatada en polvo, BSA, etc.) para optimizar la concentración de la reacción y el tiempo de bloqueo. Al mismo tiempo, preste atención a prevenir la reacción cruzada entre anticuerpos y agentes bloqueantes, así como agentes bloqueantes y. antígenos diana, biotina endógena o avidina/cadena. Incompatibilidades de micoavidina.
②La limpieza de la membrana es insuficiente. Aumentar adecuadamente el número de lavados de membrana, relajar el volumen del tampón y aumentar el porcentaje de Tween 20 puede mejorar el problema del fondo alto causado por un lavado insuficiente de la membrana;
③Aplicación de anticuerpos. La alta concentración de anticuerpo primario es una de las razones del alto nivel de fondo. El anticuerpo secundario puede estar separado de manera no específica del agente bloqueador. Se recomienda optimizar adecuadamente la concentración de anticuerpo primario y configurar un control negativo de anticuerpo secundario.
④Largo tiempo de exposición. Se recomienda utilizar tiempos de exposición adecuados en los experimentos.
4. Las tiras están dispersas o tienen formas extrañas
A veces, la posición de la banda en el cuadro de resultados del WB es la esperada, pero no se puede utilizar debido a factores como la banda. dispersión y forma extraña. Esta situación se debe principalmente a problemas durante la preparación del gel o la electroforesis, como se muestra a continuación:
①El voltaje y la corriente son demasiado altos durante la electroforesis. Hará que aumente la velocidad de migración de la banda, que aumente la temperatura de SDS-PAGE y puede causar que las bandas se dispersen y se deformen. Se recomienda utilizar condiciones de electroforesis adecuadas y mantener una temperatura baja;
②El electrodo está desequilibrado. Esto hará que la tira reactiva se tuerza, lo que se puede evitar agregando una cantidad igual de tampón de muestra al pocillo de plástico sin muestra al cargarla;
(3) Cuando la cantidad de muestra es demasiado alta, la sal concentración de iones en la muestra alta. Una carga excesiva de la muestra puede causar dispersión de bandas y las diferencias en las concentraciones de iones de sal en la muestra pueden causar bandas desiguales y otros problemas. Por lo tanto, asegúrese de que los tamaños de las muestras sean variados y apropiados, y mantenga las mismas concentraciones de iones de sal y menores.
④El problema de la fabricación de pegamento. Asegúrese de revolver uniformemente al mezclar el pegamento. Antes de cargar la muestra, use una aguja para enderezar el orificio del pegamento y elimine las burbujas de aire en el orificio del pegamento.
⑤El tampón de electroforesis ha estado almacenado durante demasiado tiempo. Dejar el tampón durante demasiado tiempo en un experimento de electroforesis tendrá efectos adversos en los resultados. Se recomienda reemplazar el tampón a tiempo.
5. Distribución desigual de las manchas en la película
A veces, después de que WB produce un resultado, además de la tira objetivo, hay manchas irregulares esparcidas en la película, que también pueden tener un gran impacto en los resultados. Las principales razones de este problema son las siguientes:
(1) Contaminación de reactivos, instrumentos, etc. Se recomienda prestar atención a la limpieza de los instrumentos experimentales antes y después de cada experimento y reemplazar rápidamente los reactivos problemáticos;
(2) Hay burbujas de aire durante la transferencia de la película. Asegúrese de eliminar las burbujas de aire durante el proceso de transferencia de la película;
③Contacto insuficiente entre el anticuerpo y la membrana durante el proceso de incubación. Asegúrese de que la cantidad total de líquido durante la incubación del anticuerpo sea suficiente, distribuya el anticuerpo uniformemente y detenga la incubación mientras agita.
④Tiempo de exposición. La sobreexposición hará que las manchas se vuelvan más evidentes, por lo que se recomienda utilizar un tiempo de exposición adecuado;
⑤La película es aburrida. Durante el experimento, es necesario asegurarse de que haya suficiente solución de reacción para evitar la aparición de una película seca.