¡Pesado! ¡Una revisión de pautas no causales lidera la nueva tendencia en tecnología proteómica de biopsia líquida!

Este artículo presenta brevemente los principios de las tecnologías proteómicas de alto contenido (Figura 1) que pueden detectar al menos cientos de proteínas a partir de muestras de biopsia líquida, incluida la tecnología de microarrays de proteínas inversas RPPA (proporcionada por Abiotic Factors), masa tecnología de espectrometría, tecnología de matriz de antígeno/anticuerpo, tecnología de detección basada en aptámeros y tecnología de extensión ortogonal (PEA), y comparó las ventajas y desventajas de las tecnologías anteriores (Tabla (enlace original: https://doi.org/10.165438 +

Antecedentes de la investigación sobre biomarcadores de biopsia líquida en proteómica

En comparación con la biopsia de tejido, el "estándar de oro" para el diagnóstico de tumores, la biopsia líquida puede obtener muestras de prueba mediante métodos mínimamente invasivos, superar la heterogeneidad y lograr dinámica. Monitoreo Los fluidos corporales que se utilizan actualmente para la biopsia líquida son principalmente sangre y orina, pero en teoría la biopsia líquida es aplicable a cualquier circulación del cuerpo humano u otros fluidos relacionados con el cuerpo humano (Figura 2). Objetivo en la mayoría de las terapias contra el cáncer, el análisis de múltiples datos proteómicos puede proporcionar información clínica más valiosa en tiempo real en todas las etapas de la progresión del cáncer. El proteoma en muestras de biopsia líquida tiene un gran potencial, como cambios continuos y rápidos en la abundancia de proteínas. Al mismo tiempo, la tecnología proteómica todavía tiene ciertas limitaciones en comparación con la tecnología de secuenciación altamente compleja, lo que hace que la exploración del proteoma aún esté por detrás de la tecnología genómica y la práctica clínica. La eficiencia de la traducción es extremadamente baja, y solo más de 40. Actualmente se encuentran disponibles biomarcadores proteómicos basados ​​en biopsia líquida. Por lo tanto, se necesita urgentemente una nueva tecnología de proteínas para lograr el objetivo de encontrar biomarcadores en la biopsia líquida del cáncer.

Comparación de varias tecnologías

1. Análisis de espectrometría de masas

Debido a la complejidad de las proteínas en las muestras de fluidos corporales, la tecnología moderna de espectrometría de masas ha cambiado el modo de escaneo de la espectrometría de masas para mejorar la precisión de la detección. utilizarse como el método preferido para el descubrimiento temprano de biomarcadores en muestras de fluidos corporales cancerosos. Los principales son: (1) En las tres etapas de descubrimiento, verificación y verificación, la "estrategia triangular" en la que el número de muestras aumenta gradualmente y. el rango de proteínas detectadas disminuye gradualmente; (2) En las etapas de descubrimiento y verificación, el método de escopeta se utiliza en una gran cola de muestras para detectar tantas proteínas como sea posible. El análisis paralelo muestra que las proteínas con diferencias significativas se pueden utilizar como cuasi biomarcadores. en la "estrategia rectangular". Actualmente, la biopsia líquida basada en espectrometría de masas se ha aplicado a cánceres como el cáncer de ovario, el cáncer del sistema urinario y el cáncer colorrectal. debe simplificar y estandarizar el proceso de detección, mejorar el rendimiento, la precisión y la solidez de la detección, y superar las limitaciones de detección de las proteínas modificadas postraduccionalmente.

En segundo lugar, la tecnología de matriz de antígenos/anticuerpos

. La matriz de anticuerpos es un método para detectar múltiples muestras objetivo (generalmente cientos) mediante la inmovilización de anticuerpos específicos en un sustrato plano modificado mediante fluorescencia, quimioluminiscencia o marcaje de oligonucleótidos. Este método es adecuado para análisis serológicos, como la detección de baja abundancia relacionada con tumores. proteínas secretadas. Sin embargo, debido a las limitaciones en el rendimiento de la detección, el rango dinámico de detección, el efecto por lotes, la saturación de la señal y la precisión cuantitativa, las matrices de anticuerpos solo se pueden utilizar como un método para el análisis de proteomas basado en fluidos corporales. La matriz de antígenos, también conocida como matriz de proteínas funcionales, se puede utilizar como plataforma de detección de antígenos para detectar cambios sutiles en la composición de los anticuerpos. Una aplicación temprana popular es el estudio de biomarcadores mediante autoanticuerpos séricos (AAB). La gama de antígenos humanos más completa cubre más del 81% de las proteínas y es una poderosa herramienta para el análisis panorámico de las proteínas sanguíneas. Sin embargo, la escalabilidad del objetivo, la reproducibilidad, el efecto por lotes y el alto costo de las matrices de antígenos aún limitan sus aplicaciones.

En tercer lugar, la detección basada en aptámeros

SOMAscan es una herramienta de detección cuantitativa de proteomas recientemente desarrollada por Qualcomm. Se basa en cuerpos proteicos modificados lentamente y puede unirse firmemente a diferentes proteínas. SOMAmer es un ligando oligonucleotídico que se conjuga con un conector fotolítico o una etiqueta fluorescente.

Después de la identificación conformacional y la purificación mediada por biotina, las proteínas eluidas se irradian con luz ultravioleta y se caracteriza y cuantifica su abundancia de proteínas en la muestra de reacción. Este método tiene una especificidad y afinidad ultraaltas con poca variación entre lotes. Actualmente, se pueden analizar más de 7000 tipos de proteínas en paralelo, lo que desempeña un papel clave en la detección de biomarcadores clínicamente relevantes para el cáncer colorrectal y el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Sin embargo, en comparación con la detección de anticuerpos, los tipos de aptámeros de ácidos nucleicos actualmente disponibles para la investigación son limitados, especialmente el desarrollo de aptámeros de ácidos nucleicos orientados a proteínas modificadas postraduccionalmente aún está en su infancia. Al mismo tiempo, debido a la alta afinidad de los aptámeros de ácidos nucleicos por los determinantes antigénicos, una gran cantidad de señales interferirán con el estudio de los marcadores de proteínas y afectarán la precisión de la detección.

4. Tecnología de extensión adyacente (PEA)

PEA combina el inmunoensayo basado en anticuerpos (ELISA) con la tecnología de PCR o secuenciación de segunda generación (NGS). En comparación con la espectrometría de masas, la PEA puede detectar un rango dinámico más amplio con volúmenes de muestra más bajos, con alta sensibilidad, alta precisión, repetibilidad y alta fidelidad. Olink comercializa la detección de PEA más avanzada en la actualidad y puede realizar mediciones estándar en 3072 objetivos. La PEA se utilizó por primera vez para identificar marcadores sanguíneos de pronóstico para el cáncer colorrectal y posteriormente para la detección temprana, diagnóstico complementario y seguimiento de enfermedades en ovario, próstata y otros tipos de cáncer. La detección de PEA depende del método de lectura (qPCR, NGS), y aún es necesario considerar el error experimental y los efectos del lote al analizar grandes cohortes de muestras. En segundo lugar, el estudio de proteínas modificadas postraduccionalmente supone un importante obstáculo para el desarrollo de anticuerpos, y su captura está hasta cierto punto limitada.

Tecnología de microarrays de proteínas inversas (RPPA) de Verb (abreviatura de verbo)

La RPPA se originó hace 20 años. Inmoviliza lisados ​​de proteínas completamente desnaturalizados en portaobjetos de vidrio especiales. Normalmente, cada lisado se diluirá en un gradiente de concentración. Luego, los portaobjetos manchados se incuban con anticuerpos altamente específicos y la información cuantitativa se captura mediante cromatografía química de amplificación de señal o detección de fluorescencia (Figura 3). RPPA se puede utilizar ampliamente para análisis paralelos ultraestables de cientos a más de 1000 muestras grandes con una cuantificación precisa. Puede detectar de forma sistemática y en profundidad más de 500 proteínas receptoras de la superficie celular, proteínas de señalización celular clave y modificaciones de proteínas (fosforilación, acetilación, metilación, etc.), proteasas, factores de transcripción y otros objetivos representativos, incluida la absorción directa e indirecta de proteínas. análisis de red. Según las características anteriores, RPPA se usa ampliamente en el Proyecto de mapeo del genoma del cáncer (TCGA) y sus conjuntos de datos públicos están disponibles en línea (TCPA, http://tcpaportal.org). Debido a su mínima variación entre lotes, RPPA puede servir como una poderosa herramienta para la validación de biomarcadores en proteínas y se ha aplicado con éxito a la validación de nuevos biomarcadores para el cáncer de pulmón. Además, la detección de proteínas exosomales se ha convertido en otra aplicación candente de RPPA en la biopsia líquida del cáncer. Abiotic ha construido una plataforma de tecnología de análisis RPPA basada en el estándar de oro del MD Anderson en China, ha completado una serie de desarrollo, verificación y optimización del flujo de trabajo por adelantado, ha ampliado continuamente la biblioteca de anticuerpos y ha establecido un sistema de análisis de información original completo. Ayudar a los investigadores científicos, trabajadores clínicos y usuarios nacionales relacionados con la investigación y el desarrollo de medicamentos a realizar de manera rápida y eficiente análisis panorámicos de las enfermedades, especialmente las vías de señalización relacionadas con los tumores, la extracción de mecanismos moleculares, la investigación farmacológica relacionada con los tumores y el desarrollo de medicamentos dirigidos. Los complejos procesos técnicos de la RPPA y los estrictos procesos de detección de anticuerpos ya no serán un obstáculo para que los investigadores nacionales lleven a cabo investigaciones médicas básicas y traslacionales. (Haga clic en "Leer el texto original" a continuación para obtener más detalles)

Perspectivas

En el futuro, bajo la premisa del desarrollo continuo de la tecnología proteómica, la aplicación conjunta y complementaria de diversas tecnologías se puede utilizar como base para la biopsia de líquido corporal tumoral. Estrategia de validación ortogonal viable para biomarcadores (Figura 4). Los organismos no biológicos dependen de varias tecnologías genómicas nuevas, como la tecnología RPPA, cuya misión principal es la investigación y transformación del tratamiento tumoral de precisión. Esperamos con interés el surgimiento de un proceso más ágil pero coherente y estandarizado para el desarrollo de biomarcadores de proteínas que, en última instancia, se aplicará en la investigación de la medicina traslacional en el cáncer.